Различия в утилизации эфирных масел хмеля при позднем и сухом охмелении

Дж. Хейли* и Т. Л. Пеппард.
*Университет Hcriot-Watt, факультет пивоварения и биологических наук, Chambers Street, Edinburgh EH1 IHX.
(Фонд исследований пивоварения. Литтель-Холл. Нутфтельд. Суррей)
4 октября 1982 г.

Было приготовлено пиво с поздним и сухим охмелением, после чего липофильные компоненты экстрактированы с использованием смолы Amberlite XAD-2 [гидрофобный сополимер стирол-дивинилбензольной смолы, в зависимости от ароматичности и размера гидрофобных групп сорбирует органические соединения посредством низкоэнергетических физических взаимодействий – здесь и далее прим. переводчика]. Исследование летучих компонентов с помощью ГХ/МС [Газовая хромотография / Масс-спектрометрия] [Хромато-масс-спектрометрия — аналитический метод, основанный на сочетании возможностей хроматографа и масс-спектрометра, использующийся для количественного и качественного определения отдельных компонентов в сложных смесях. Газовая хроматография как нельзя лучше подходит для сочетания с ионным детектором масс-спектрометра, поскольку в колонке хроматографа соединения уже находятся в газовой фазе] подтвердило, что большая часть масла хмеля, добавленного в конце кипячения сусла, теряется при испарении. Часть материала, пережившего кипячение, трансформируется дрожжами во время брожения. Пиво с сухим охмелением содержало соединения, более характерные для исходного хмелевого масла, чем соответствующее пиво с поздним охмелением. Жидкий углекислый экстракт хмеля [имеется ввиду экстракция углекислым газом, метод используется для получения высококачественных экстрактов], богатый эфирным маслом, фракционировали с помощью колоночной хроматографии на оксиде алюминия-диоксиде кремния, получая препараты, которые имитируют характер позднего или сухого охмеления.
Ключевые слова: пиво, сухое охмеление, вкусовой профиль, фракционирование, хмелевое масло, позднее охмеление, масс-спектрометрия.

ВВЕДЕНИЕ
Хмелевой характер – это аромат, который придает пиву эфирное масло хмеля. Традиционно для его получения используют либо сухое, либо позднее охмеление^[12]. Сухому охмеление, часто используют при производстве элей т. е. часть хмеля добавляется в пиво после брожения. Тогда как, в качестве альтернативы при варке лагерного пива порция хмеля добавляется в конце кипячения (позднее охмеление).
На данный момент в количественном отношении состав эфирного масла хмеля хорошо определен. Были предприняты многочисленные попытки идентифицировать соединения, ответственные за вкус хмеля в пиве ^{[4][8][10][11][13][17][19][21][22][23][29][31][34]}. Однако до настоящего времени эти исследования имели ограниченный успех, потому что уровни отдельных компонентов эфирного масла в пиве чрезвычайно низкие по сравнению с уровнями продуктов ферментации. Кроме того, некоторые из используемых процессов экстракции либо были недостаточно эффективны для извлечения желаемых соединений, либо позволяли соединениям подвергаться термической деформации. Трессл и другие исследователи^[34][35] идентифицировали многие природные и преобразованные компоненты хмелевого масла в лагере, в то время как химический состав хмелевых масел в элях с сухим охмелением, оказался менее изучен. Однако ни в том, ни в другом случае не ясно, какие группы соединений отвечают за хороший хмелевой вкус. После того, как часть хмеля была добавлена в сусло (как в случае позднего охмеления) или в фактически готовое пиво (как при сухом охмелении), составляющие эфирного масла подвергаются различным физическим, химическим и биохимическим процессам. В настоящем исследовании были изучены различия в химическом составе соединений, производных от хмеля, присутствующих в пиве с поздним и сухим охмелением, и были предприняты попытки улучшить использование компонентов хмелевого масла.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ (Результаты и обсуждения)
Пиво с «сухим охмелением» и «поздним охмелением» моделировалось с использованием экстракта хмеля, полученного обработкой хмеля Styrian Golding жидким углекислым газом^[5][30][32]. Анализ вкусового профиля этих сортов пива с использованием специального формата^[14] для хмелевого вкуса показал, что во вкусе этих двух сортов пива были различия. В частности, пиво с поздним охмелением получило более высокие баллы по эфирно-фруктовым и фруктово-цитрусовым оттенкам, чем соответствующее пиво с сухим охмелением. Причины различий во вкусе такого пива были нами исследованы. Исследование включало определение того, насколько охмеленное пиво отличается по составу от контрольного пива, которое не было обработано препаратом, содержащим хмелевое масло.

Анализ пива с поздним охмелением:
Для исследований позднего охмеления были использованы жидкие углекислотные экстракты хмеля, содержащие повышенное количество хмелевого масла. Эти препараты добавляли через 5 минут после окончания кипячения сусла, и если бы все масло «выжило», то в готовом пиве присутствовало бы 40 ppm. Однако хмелевое масло легко испаряется вместе с водяным паром^[33], и даже после всего 5 минут кипения большая часть хмелевого масла теряется. Маловероятно, что более 2 частей на миллион хмелевого масла осталось в сусле до внесения. Потери из-за перегонки с водяным паром были подтверждены экспериментом, в котором пары, покидающие сосуд, конденсировались и собирались в течение двух 5-минутных периодов, непосредственно перед добавлением позднего охмеления и затем после него. Полученные порции дистиллята экстрагировали, концентрировали и затем исследовали методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Как и ожидалось, последний дистиллят, как было обнаружено, содержал большое количество компонентов хмелевого масла, тогда как дистиллят, собранный до позднего охмеления, практически не содержал их; он содержал сравнительно низкие уровни нескольких соединений, полученных из солода.
Порции контрольного сусла и сусла с поздним охмелением были взяты для немедленного анализа, в то время как большая часть подверглась ферментации. Как и ожидалось, что касается летучих компонентов, между суслами с поздним охмелением и контрольными суслами наблюдались существенные различия в составе. Первый отличался наличием более 50 дополнительных компонентов, многие из которых были идентифицированы путем сравнения масс-спектров и индексов удерживания Коваца^[36] с данными аутентичных соединений, измеренными в лаборатории или цитированными в литературе^[15][34][35]. Компоненты хмелевого масла, присутствующие в сусле, многие из которых присутствовали в относительно высоких концентрациях, включали монотерпеновые и сесквитерпеновые углеводороды, кислородсодержащие производные терпена, спирты и кетоны, а также сложные эфиры метилового и терпенового спиртов^[33].
Аналитические исследования выявили менее двадцати соединений, полученных из хмелевого масла, общих как для сусла с поздним охмелением, так и для готового пива. Во всех случаях уровни таких соединений, обнаруженные в готовом пиве, были значительно ниже, чем в сусле. Далее было отмечено, что, за исключением линалоола, оксидов линалоола и 2-мирценола, уровни соединений хмелевого масла, по-видимому, снижаются в бутылочном пиве, хранящемся в течение 3 месяцев при температуре 13 ° C. Этот результат в целом согласуется с данными Пикетта и др.^[26], которые наблюдали уменьшение интенсивности охмеления пива, обработанного эмульсиями хмелевого масла.
Таблица I показывает относительные количества некоторых соединений хмелевого масла, которые присутствовали как в сусле с поздним охмелением, так и в соответствующем пиве. Эти соединения были определены количественно путем измерения интенсивности выбранных ионов относительно интенсивности иона m/i 82 в масс-спектре добавленного внутреннего стандарта (l-карвона).

ТАБЛИЦА I. Относительные количества отдельных соединений, общих для позднего охмеления сусла и пива, а также пива после сухого охмеления

Соединение	Встречается в сусле с поздним охмелением	Встречается в пиве с поздним охмелением	Встречается в пиве с сухим охмелением
Мирцен	178,1	1,0	385,4
Гумулен	66,2	1,0	160,1
Линалол	1,2	1,0	1,0
2-Ундеканон	157,5	1,0	227,3
Изобутил изобутаниол	7,7	1,0	12,5
Пентил пропаноат	4,4	1,0	7,1
Метил 4-деканоат	31,8	1,0	31,1
Метил геранат	1,7	1,0	2,5
Метил 4,8- декадиеноат	13,4	1,0	9,5

 

Метод количественного определения одного иона был необходим, поскольку ряд представляющих интерес соединений не был хроматографически отделен от других компонентов сусла или пивных экстрактов. Однако, поскольку отдельные соединения могут в некоторых случаях иметь заметно разные факторы ответа, относительные уровни, указанные в таблице I, явно сопоставимы только для данного соединения и поэтому были выражены относительно самого низкого измеренного уровня.
Когда пиво с поздним охмелением сравнивали с контрольным пивом, был отмечен ряд различий в дополнение к тем, которые были вызваны прямым «выживанием» составляющих хмелевого масла. В пиве с поздним охмелением были обнаружены вторичные спирты, которые отсутствовали, и в сусле с поздним охмелением, и в контрольном пиве. Очевидно, что во время брожения дрожжи ответственны за химическое преобразование некоторых соединений, полученных из хмеля. Например, Баттери и другие^[4] и Никельсон и Ликенс^[21] сообщали о переэтерификации метиловых эфиров в этиловые эфиры. Аналогичным образом сообщалось и о химическом восстановлении карбонильных соединений во время ферментации при производстве различных алкогольных напитков. Пеппад и Халси^[25] сообщали о химическом восстановлении ряда альдегидов и кетонов, полученных из солода, в основном до первичных и вторичных спиртов и соответствующих эфиров ацетата. Совсем недавно эти исследователи обнаружили, что нонановая кислота, являющаяся летучим продуктом, образуется в наибольшем количестве при добавлении 2-ноненаля в ферментирующее сусло. В настоящих исследованиях наиболее заметными продуктами дрожжевой трансформации, обнаруженными в пиве с поздним охмелением, были 2-нонанол, 2-деканол, 2-ундканол и 2-тридеканол, которые почти наверняка образовывались из соответствующих метилкетонов.

Влияние ферментации на основные составляющие хмелевого масла:
Исследование данных ГХ/МС показало, что все эфиры, наблюдаемые в пиве с поздним охмелением, присутствовали на аналогичных уровнях в контрольном пиве. Впоследствии было показано, что ферментация (см. Экспериментальный раздел), к которой метилгептаноат добавляли перед инокуляцией дрожжами, вырабатывала в основном гептановую кислоту (выход 35%), хотя можно было обнаружить только следовые количества метилгептаноата и этилгептаноата. Терстон показал, что пивные дрожжи обладают ферментом, способным гидролизовать сложные эфиры, такие как ацетаты, бутаноаты, гексаноаты, октаноаты и деканоаты. Он обнаружил, что гептановая кислота была получена с выходом 80% из этилгептаноата, добавленного при ферментации. Следовательно, гидролиз насыщенных сложных эфиров, по-видимому, является важным процессом, который происходит во время ферментации, в то время как переэтерификация является лишь относительно незначительной реакцией.
Потери микропримесей органических соединений в сусле во время ферментации также происходят разными путями, кроме химической трансформации. К ним относятся удаление летучих соединений за счет уноса диоксидом углерода и потеря большего количества липофильных компонентов в результате сорбции на дрожжевой массе^[8][34]. Был проведен эксперимент, чтобы установить, могут ли дрожжи метаболизировать некоторые терпеноиды хмелевого масла и образовывать другие летучие продукты. Эксперимент включал сравнение двух порций питательной среды (обе содержат гумулен и различные продукты окисления гумулена), одна из которых была засеяна дрожжами, а другая, контрольная – нет. Результаты этого эксперимента позволяют предположить, что гумулен и продукты его окисления не превращались дрожжами в другие летучие вещества, так как не было обнаружено никаких новых продуктов. Однако из бульона было получено лишь небольшое количество извлеченных терпеноидов с относительно высоким липофильным характером (например, гумулена лишь 12%); предположительно остаток был сорбирован дрожжевой массой. Производные гумулена с более низкой липофильностью обычно извлекались с большим выходом (например, выход гумулендиэпоксида 78%).

Анализ пива с сухим охмелением:
Пиво с сухим охмелением было приготовлено путем добавления части той же партии экстракта диоксида углерода, которая использовалась в предыдущих исследованиях, связанных со вкусом позднего охмеления. Экстракт добавляли к пиву в емкостях для кондиционирования, и полученное готовое пиво анализировали на летучие соединения хмеля. Концентрат этого пива содержал намного больше летучих компонентов, полученных из хмеля, чем образец пива с поздним охмелением, причем в первом было обнаружено более 50 компонентов. Компоненты хмелевого масла, общие как для сусла с поздним охмелением, так и для пива после сухого охмеления, присутствовали в последнем в более высоких количествах, даже несмотря на то, что первое было обработано примерно восьмикратным количеством хмелевого масла (Таблица I). Кроме того, химическая природа соединений, переносимых из экстракта хмеля в пиво во время сухого охмеления, заметно контрастировала с таковой у веществ, содержащихся в пиве с поздним охмелением. Таким образом, соединения хмелевого масла, которые сохраняются в пиве после позднего охмеления, имеют тенденцию быть более полярными по природе, в то время как пиво с сухим охмелением дополнительно содержит относительно высокие уровни неполярных монотерпеновых и сесквитерпеновых углеводородов. Фактически, аналогичный спектр соединений был обнаружен в сусле с поздним охмелением до ферментации, хотя некоторое количество кислородсодержащих терпенов, обнаруженных в сусле, отсутствовало в пиве после сухого охмеления. Предыдущие исследования, проведенные с терпенами, такими как мирен^[7] и гумулен^[27], показали, что такие соединения легко превращаются в кипящей воде в ряд кислородсодержащих веществ, например линалоол, гераниол и нерол из мирена, а также эпоксиды и гумулкнолы гумулена из гумулена. В некоторых случаях было показано, что аналогичные превращения происходят и в кипящем сусле. В настоящих исследованиях соединениями, обнаруженными в сусле с поздним охмелением, но не в пиве после сухого охмеления, были эфир хмеля, эфир Карахана и два изомера оксида линалоола. Эти соединения, по-видимому, образуются, по крайней мере частично, под действием тепла в течение короткого периода, в течение которого хмелевое масло контактирует с кипящим суслом. Как упоминалось ранее, ряд вторичных спиртов был идентифицирован в пиве с поздним охмелением, но не мог быть обнаружен в пиве с сухим охмелением. Это соответствует тому, что они являются продуктами метаболизма дрожжей.

Состав и пивоваренные свойства фракционированного экстракта хмеля:
Ввиду очевидных различий в природе соединений хмеля, сохраняющихся в пиве с поздним и сухим охмелением, было решено фракционировать жидкий углекислый экстракт хмеля и определить относительный потенциал различных фракций для достижения двух разных типов хмелевого характера. Экстракт «с высоким содержанием масла» хмеля Styrian Golding^[5][30][32] подвергали колоночной хроматографии на оксиде алюминия - диоксиде кремния с использованием растворителей с постепенно увеличивающейся полярностью и собирали пять фракций (I-V) (см. Экспериментальный раздел).
Фракция I включает моно- и сесквитерпеновые углеводороды, основные компоненты включают мирцен, кариофиллен и гумулен^[33][35].
Фракция II из более чем 30 идентифицированных компонентов подавляющее большинство составляли сложные эфиры. К ним относятся ряд сложных тиоэфиров^[24], а также сложные эфиры метилового и терпенового спиртов^[33][35]. Помимо небольших количеств нескольких терпеновых углеводородов, единственными другими соединениями, обнаруженными во фракции II, были два терпенметилсульфида^[9][20].
Фракция III содержала более 50 идентифицированных соединений приблизительно половина из которых были сложными эфирами. По сравнению с фракцией II эти сложные эфиры содержали относительно большие количества более высоконенасыщенных соединений (таких как метилгеранат и метилдодекадиеноат), но не содержали тиоэфиров. Другим заметным классом соединений во фракции III (не обнаруженным во фракции II) были кетоны^[35]. Они включали как насыщенные, так и ненасыщенные соединения, большинство из которых были с прямой цепью. Фракция III также содержала ряд других соединений, включая несколько циклических простых эфиров и небольшие количества двух спиртов^[33][35].
Фракция IV была богата спиртами и множеством различных циклических эфиров, большинство из которых были терпеноидными по природе.
Была сварена серия пива с поздним охмелением, в котором различные фракции были добавлены в сусло за 5 минут до окончания кипячения. Кроме того, было сварено контрольное пиво, которое не было обработано хмелевым маслом, и еще одно пиво с поздним охмелением было произведено путем добавления части нефракционированного экстракта диоксида углерода в кипящее сусло. Список не является исчерпывающим, он предназначен для демонстрации типов соединений, характерных для различных фракций.

ТАБЛИЦА II. Влияние фракций экстракта Styrian Golding на вкус пива

Фракция	Процент доступного масла	Процент общего экстракта	Хмелевой аромат, получаемый при использовании в пивоварении
I	58,5	19	сухое охмеление
II	8,2	2,7	нет
III	21,8	7,1	сухое охмеление
IV	11,5	3,7	позднее охмеление
V	42	42,4	нет

Вкус пива, сваренного из различных фракций, был сравнен с поздне-охмеленным пивом, произведенным из нефракционированного экстракта с использованием серии треангулярных тестов^[1]. Пиво, обработанное фракцией IV, нельзя было отличить от поздне-охмеленным пива, сваренного с использованием цельного экстракта. Однако пиво, сваренное из других фракций, сильно отличалось. При ранжировании вкусовых качеств все дегустаторы посчитали, что из пива с поздним охмелением фракциями I-V, пиво, сваренное с использованием фракции IV, имело наиболее интенсивный вкус.
Однако от позднего охмеления трудно получить постоянно воспроизводимые ароматы. Все из-за различий в уровне эфирного масла в разных партиях хмеля, а также различий в степени выделения углекислого газа во время брожения. Кроме того, также необходимо учитывать изменение скорости испарения во время варки сусла при сравнении поздне-охмеленного пива, произведенного на разных пивоварнях. Для получения воспроизводимого хмелевого вкуса лучше всего добавлять эфирное масло хмеля после ферментации.
Показав, что одна фракция экстракта хмеля, добавленная незадолго до окончания кипячения сусла, дает хороший характер хмеля, было решено проверить, будет ли добавление аналогичной фракции после ферментации также обеспечить приемлемый хмелевой характер. Однако полученное пиво было легко отличимо с помощью треангулярного теста вкуса^[1], от контрольного образца в который был добавлен поздний охмеление цельным экстрактом. В другом испытании часть фракции IV добавляли в пиво в начале ферментации. Вкус этого пива также отличался от пива с поздним охмелением в тесте. Эти результаты означают, что для получения характерного вкуса позднего охмеления требуется некоторая термическая обработка.
Была сварена серия сортов пива, чтобы выяснить, будет ли какая-либо фракция экстракта хмеля Styrian Golding имитировать характер сухого охмеления. Отдельные фракции добавляли в бочки с пивом перед оклейкой, и ароматы полученных продуктов сравнивали в ранжированном вкусовом тесте. Пиво, обработанное фракциями I и III, по мнению дегустаторов, имело ярко выраженные вкусовые нотки сухого охмеления. Вкусы этих двух сортов пива также сравнивались с использованием специального вкусового профиля, упомянутого ранее^[14]. Результаты показали, что пиво, сваренное с использованием фракции I, имело более интенсивный хмелевой вкус и аромат, чем пиво, сваренное с фракцией III. Кроме того, в то время как фракция I давала заметные травянистые вкусовые нотки, фракция III отвечала за повышенные оценки по термину эфирно-фруктовый. Интересно отметить, что ароматы, полученные с использованием фракций II, IV и V, не напоминали ароматы пива после сухого охмеления.
В Таблице II представлены типы характера хмеля, если таковой имелся, произведенные пятью фракциями экстракта хмеля, а также дает процент доступного масла, присутствующего в каждой. Состав масел во фракциях I-IV был исследован с помощью ГХ/МС, в то время как фракция V, содержащая смолистый материал, не подходила для анализа с помощью капиллярной ГХ/МС. В каждой из фракций I-IV было охарактеризовано 20-50 соединений, идентичность была подтверждена обычным образом с использованием данных индекса удерживания Коваца^[15][34][35].

В таблице III перечислены некоторые компоненты хмелевого масла, которые были идентифицированы;

ТАБЛИЦА III. Выборка компонентов хмелевого масла, содержащихся во фракциях жидкого углекислого экстракта хмеля

Процент летучих веществ в долях
Компонент	I	II	III	IV
Углеводороды
ß-Пинен	0,8	ПС	НО	НО
Мирцен	43,9	0,2	НО	НО
d-Лимонен	0,2	НО	НО	НО
Транс-Оцимен	ПС	НО	НО	НО
a-Копаен	0,2	НО	НО	НО
Кариофилен	10,6	ПС	НО	НО
Гумулен	19,8	0,7	ПС	ПС
Гермакрен-D	ПС	ПС	НО	НО
ð-Кадинен	1,7	ПС	НО	НО
Эфиры
Метил гептаноат	НО	3,1	1,3	НО
Метил 4-метил-2-гептаноат	НО	ПС	1,8	НО
Метил 4-ноненоат	НО	0,6	0,6	НО
Метил 4,8-декадиеноат	НО	ПС	0,3	ПС
Метил геранат	НО	1,4	1,6	НО
Метил додекадиеноат	НО	0,5	2,2	НО
Изобутил изобутаноат	НО	7,8	1,4	НО
2-Метилбутил изобутаноат	НО	41,7	6,4	ПС
Изоамил пропаноат	НО	2,2	1,4	НО
Гептил изобутаноат	НО	1,2	0,2	НО
Нерил изобутаноат	НО	0,8	0,2	НО
S-Метил 2-метилбутанетиоат	НО	0,1	НО	НО
S-Метил хексанетиоат	НО	1,5	НО	НО
Кетоны
6-Метил-5-гептенон-2	НО	НО	НО	ПС
2-Нонанон	НО	НО	1,2	НО
2-Андеканон	НО	НО	10,0	0,2
Тридекенон-2	НО	НО	0,8	НО
Метилтетрадеканон-2	НО	НО	0,6	НО
Пентадекадиенон-2	НО	НО	8,8	1,3
2-Гептадеканон	НО	НО	0,4	НО
ß-Ионеон	НО	НО	НО	ПС
Спирты
2-Метил-3-бутенол-2	НО	НО	ПС	0,5
l-Октенол-3	НО	НО	НО	ПС
Линалоол	НО	НО	НО	32,0
Неролидол	НО	НО	НО	0,7
Эпикубенол	НО	НО	НО	1,0
T или ð-Кадинол	НО	НО	НО	3,1
Гумуленол-II	НО	НО	0,1	0,7
Другое
Эфир хмеля	НО	НО	ПС	ПС
Карахана эфир	НО	НО	ПС	ПС
2,2,7,7-Тетраметил-1,6-диоксопиро(4,4)нонадиен-3,8	НО	НО	ПС	ПС
5,5-Диметил-2(5Н)-фуранон	НО	НО	ПС	0,3
Транс-фураноид оксид линаоола	НО	НО	НО	0,9
Цис-фураноид оксид линаоола	НО	НО	НО	0,6
Эпоксид кариофилена	НО	НО	1,7	8,2
Эпоксид гумулена-I	НО	НО	0,5	1,5
Эпоксид гумулена-II	НО	НО	4,2	27,1
Диэпоксид гумулена	НО	НО	0,2	0,9
4-Метил-3-пентеноик кислота	НО	НО	НО	0,1
НО = Не определяется
ПС = Присутствие следов (< 01%)

ВЫВОДЫ

Настоящие исследования показали, что как углеводороды, так и некоторые кислородсодержащие компоненты эфирного масла хмеля вносят заметный вклад в хмелевой вкус пива, обработанного сухим хмелем. Однако только кислородсодержащие компоненты хмелевого масла, такие как спирты и циклические эфиры, ответственны за привкус позднего охмеления в пиве.
Эта работа показывает, что использование эфирного масла хмеля может быть улучшено путем разделения масла на фракции перед использованием. Таким образом, комбинация фракций I и III дала бы концентрат, который дает сильный привкус сухого охмеления в пиве, в то время как фракцию IV можно использовать там, где требуется альтернативный характер позднего охмеления. Тепловая обработка фракции IV должна лежать в основе процесса получения концентрата, который придает пиву после ферментации привкус позднего охмеления. Таким образом, существует вероятность того, что характер «позднего охмеления» и «сухого охмеления» будет получен эффективно и воспроизводимо.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты и стандарты:
Смолу Amberlite XAD-2 (BDH, Пул, Великобритания) промывали последовательно деионизированной водой (1000 мл), метанолом AR (250 мл), диэтиловым эфиром AR (1000 мл), метанолом AR (250 мл) и наконец, деионизированной водой (1000 мл).
Диэтиловый эфир AR и н-пентанк перед использованием подвергали повторной перегонке.
Этанол был абсолютным алкоголем AR (Джеймс Берроуз, Лондон, Великобритания).
Подлинные соединения хмеля были либо выделены из коммерческого масла хмеля (Pauls & Whites Int'l, Reigate, UK) с использованием опубликованных методов, либо были получены из коммерческих источников: BDH, Aldrich Chemical Co (Gillingham, UK), Koch-Light (Colnbrook, UK), Givaudan (Кройдон, Великобритания).

Инструментальные анализы:
Комбинированный газовый хроматограф - масс-спектрометр с использованием системы Finnigan 1020 GC-MS. Хроматографическое разделение выполнялось с помощью колонки из плавленого кварца WCOT размером 50 м × 0,3 мм, покрытой Carbowax 20M (Hewlett-Packard, Wokingham, UK). Гелий (чистота CP, BOC) использовали в качестве газа-носителя с линейной скоростью 28 см / с, а программа температуры печи составляла от 60 ° C до 220 ° C при повышении температуры на 37 минут. Индексы удерживания Коваца^[36] измеряли путем совместной инъекции концентрированных экстрактов (3 мкл) с разбавленным раствором н-алканов C, -CJ6 (200 частей на миллион каждый) в эфире (2 мкл).
Эффлюент из капиллярной колонки подавался непосредственно в источник масс-спектрометра через нагретую стеклянная капиллярная линия передачи с внутренним диаметром 0,1 мм. Температура источника составляла 809 ° C, а линия передачи поддерживалась при 230 ° C. Масс-спектры, измеренные при энергии ионизации 70 эВ, сканировались от m / z 33 до 350 каждую 1 с. Все полученные данные были сохранены на диске для последующего использования. Чтобы помочь идентифицировать неизвестные компоненты. Масс-спектры сравнивали, используя компьютеризированные средства поиска библиотеки, со стандартной коллекцией эталонных спектров и с коллекцией эталонных спектров, собранной в лаборатории авторов.

Приготовление жидких экстрактов диоксида углерода из хмеля:
Подробная информация о процессе экстракции хмеля жидким диоксидом углерода приведена в другом месте^[5][30][33]. Экстракты, особенно богатые хмелевым маслом (36,7 мл / 100 г; α-кислота 33,8%; п-кислота 21,2%) были получены экстракцией обогащенных гранул хмеля хмеля Styrian Golding и сбором фракций экстракта, полученной в течение первых 15 минут процесса.
В большинство напитков горечь была привнесена экстрактом хмеля Wye Target, который был приготовлен путем сбора материала, элюированного в интервале между 240 и 420 мин от начала экстракции. Этот экстракт содержал 66,7% α-кислоты, 10,8% P-кислоты и незначительное количество хмелевого масла. В пиво, подвергнутое сухому охмелению фракциями экстрактом Styrian Golding, для горечи был добавлен экстракт хмеля Pride of Ringwood, содержащий 55,3% альфа-кислоты, 31,0% пара-кислоты и незначительное количество хмелевого масла.

Приготовление сусла и пива:
Сусло и пиво готовили в экспериментальном масштабе с использованием стандартной процедуры^[18] со следующими изменениями. В сусло добавлялось достаточное количество α-кислоты, чтобы пиво имело горечь 25 BU. Две трети α-кислоты было добавлено в начале кипячения сусла. Оставшуюся одну треть α-кислоты (содержащейся в жидком экстракте из диоксида углерода, богатого маслом) – за 5 минут до окончания периода кипячения в течение 1 часа.
Контрольные сусла (т.е. содержащие незначительное количество хмелевого масла) были получены, как указано выше, за исключением того, что экстракт, который был добавлен в начале кипячения, также добавлялся через 5 минут после окончания кипячения.
Пиво с «сухим охмелением» было приготовлено путем обработкои пива в бочках жидким углекислотным экстрактом хмеля в этанольном растворе по методу Скотта и др^[30].

Приготовление сусла и пивных экстрактов:
2 литра сусла или дегазированного пива с добавлением 50 частей на миллиард карвона в качестве внутреннего стандарта, было пропущено через колонку с чистой смолой Amberlite XAD-2^[16] (1,5x21 см) с приблизительной скоростью 5 мл / мин. Затем смола промывалась деионизированной водой (100 мл) и высушивалась. Компоненты сусла или пива, сорбированные на смоле, затем элюировались диэтиловым эфиром (50 мл), обеспечивая последовательное уравновешивание четырех порций в течение 10 минут каждая. Объединенный экстракт отделялся от избытка воды и сушился над безводным сульфатом натрия. Экстракт концентрировался до 0,5 мл путем осторожного нагревания на водяной бане при 43 ° C, используя методику Junk et al^[16]. Затем этот концентрат хроматографировался на колонке с помощью оксид алюминия - диоксид кремния (2:1; 9 г), элюировался диэтиловым эфиром (25 мл). Элюат собирался и концентрировался до 0,5 мл перед анализом с помощью ГХ/МС.

Фракционирование экстракта хмеля:
Как правило, экстракт хмеля Styrian Golding (5,62 г) растворяли в минимальном количестве пентана (около 6 мл), и раствор наносился на смешанную колонку с оксидом алюминия IV степени (Merck 1078) и оксидом кремния II степени (Merck 7734) (2:1; 150 г). Затем колонка последовательно элюировалась порциями по 500 мл следующих смесей растворителей: I / пентан, II / пентан-дихлорметан (9:1), III / пентан-дихлорметан (2:1), IV / пентандиклэтиловый эфир (9:1) и V / дихтиловый эфир. Фракции собирались и затем концентрировались осторожным нагреванием, как описано выше. Последние следы растворителя удалялись с помощью роторного пленочного испарения.
Влияние ферментирующих дрожжей на продукты окисления гумулена и гумулена:
Жидкие питательные среды были приготовлены в соответствии с опубликованным методом^[28]. Порции этих растворов (3 x 500 мл) аэрировали в течение 3 часов, а затем два из них обрабатывали смесью гумулена (10 мкл) и продуктов его окисления^[27] (10 мкл) в абсолютном этаноле (2 мл). Один из обработанных растворов и оставшийся необработанный раствор инокулировался Saccharomyces cerevisiae (NCYC 1245) (10 × 106 клеток / мл). Затем все три колбы, содержащие среду для выращивания, встряхивались при 25 ° C, пока устанавливался гидрозатвор. Через 43 часа две жидкости, содержащие дрожжи, центрифугировались при 3000 об / мин в течение 15 минут, а растворы, содержащие клетки на поверхности, декантировались. Все жидкости обрабатывались l-карвонком (5 мкл), а затем экстрагировали с использованием методики, описанной ранее.

Определение продуктов ферментационного превращения метилгептаноата:
Дополнительные порции питательной среды (3 x 500 мл) готовились, как ранее. Один из растворов обрабатывался метилгептаноатом (10 мкл) в метаноле (1 мл). Два контрольных раствора обрабатывались метанолом (1 мл). Затем все растворы инокулировались Saccharomyces cerevisiae (NC \ C 1245) (10 × 10 футов клеток / мл) и инкубировались в течение 65 ч при 25 ° C. Затем дрожжи удалялись центрифугированием. Одина из контрольных жидкостей обрабатывалась метилгептаноатом (10 мкл) и этилгептаноатом (10 мкл) в виде раствора в метаноле (1 мл). Все продукты ферментации экстрагировались описанным выше способом. Концентраты исследовались методом ГХ с использованием стеклянной колонки (2,8 м x 4 мм (внутренний диаметр)), заполненной Carbowax 20M.

Методы оценки вкуса:
Оценка вкусового профиля проводилась с использованием модификации^[14] метода Клаппертона^[6]. Триангулярные тесты вкуса проводили с использованием метода Бенгтссона^[1].

Благодарность: Авторы хотят выразить благодарность Дж. Барретту за проведение экспериментальных варок и директору Исследовательского фонда пивоварения за разрешение опубликовать эту статью.

ИСТОЧНИКИ

1. Bengtsson, K., Waller stein Laboratories Communications. 1953, 16(54), 231.

2. Belt, G., Peppard, T. L. & Haley, J., Journal of the Institute of Brewing, 1981,87, 158.

3. Buckee, G. K., Malcolm, P. T. & Peppard, T. I tournal of the Institute of Brewing, 1982,88, 175.

4. Buttery, R. G., Black, D. R., Lewis, M. J. & Ling, L.. Journal of Food Science. 1967,32,414.

5. Carroll, T. C. N. & Laws, D. R. J., Technical Quarterly of the Master Brewers' Association of the Americas. 1981, 18,42.

6. Clapperton, J. F., Journal of the Institute of Brewing. 1973,79, 495.

7. Dicckmann, R. H. & Palamand, S. R., Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1974, 22,498.

8. Fricse, L., Fendesack, F. & Tressl, R., Monatsschrift fiir Brauerei, 1979,32, 255.

9. Grimmctl, С. M. & Peppard, T. L., Journal of the Institute of Brewing, paper in preparation.

10. Harold. F. V., Hildebrand, R. P., Moricson, A. S. & Murray. P. J., Journal of the Institute of Brewing, 1961,67, 161.

11. Hashimoto. N.. Report of the Research Laboratories of Kirin Brewery Co Ltd. 1970, 1.

12. Hough, J. S., Briggs, D. E. & Stevens, R., Malting and Brewing Science. Chapman and Hall: London, 1971.

13. Howard, G. A., Brewers Digest. 1963, 38, 50.

14. Hudson, J. R., European Brewery Convention. Monograph VII— Flavour Symposium, Copenhagen, 1981, 17.

15. Jennings, W. & Shibamoto, T„ Qualitative Analysis of Flavour and Fragrance Volatiles by Glass Capillary Gas Chromatography. Academic Press: New York, 1980.

16. Junk, G. A.. Richard, J. J., Gricscr, M. D., Witiak, D., Witiak, J. L„ Arguelo, M. D„ Vick, R„ Svec, H. J., Fritz, J. S. & Caldcr, G. V.. Journal of Chromatography. 1974, 99, 745.

17. Kuroiwa. Y., Kobuko, E. & Hashimoto, N.. Technical Quarterly of the Master Brewers' Association of the A mericas, 1973, 10,215.

18. Laws, D. R. J.. Shannon, P. V. R. & John, G. D., Journal of the American Society of Brewing Chemists. 1976,34, 166.

19. Likens, S. T. & Nickerson, G. B., Proceedings of the American Society of Brewing Chemists. 1964, 5.

20. Moir, M., Gallagher, I. M., Seaton, J. C. & Suggett, A., Chemistry and Industry, 1980, 624.

21. Nickerson, G. B. & Likens, S. T., Journal of Chromatography. 1966,21,1. '

22. Peacock, V. E., Dcinzcr, M. L., Likens, S. T., Nickerson, G. B. & McGill, L. A., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1981,29,1265.

23. Peacock, V. E., Deinzcr, M. L.. McGill, L. A. & Wrolstad, R. E.. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1980, 28, 774.

24. Peppard, T. L., Journal of the Institute of Brewing. 1981, 87, 376.

25. Peppard. T. L. & Halsey, S. A., Journal of the Institute of Brewing. 1981,87, 386.

26. Pickett, J. A., Sharpe, F. R. & Peppard, T. L., Journal of the Institute of Brewing. 1976, 82, 330.

27. Pickett, J. A., Sharpe, F. R. & Peppard, T. L„ Chemistry and Industry. 1977.30.

28. Quain, D. E. & Haslam.J. M„ Journal of General Microbiology. 1979,111(2), 343.

29. Sandra, P. & Verzcle, M„ European Brewery Convention. Proceedings of the 14th Congress, Nice. 1975, 107.

30. Scott, R. W., Thcaker, P. D„ Marsh, A. S., Grimmctl, С. M., Laws, D. R. J. & Sharpe, F. R., Journal of the Institute of Brewing. 1981,87, 252.

31. Silbcreiscn, K... Kruger, E. & Baron, G., Monatsschrift fur Brauerei. 1970, 23, 93.

32. Sharpe. F. R., Grimmctt, С. M., Laws, D. R. J. & Belt. G., Journal of the Institute of Brewing. 1980, 86, 234.

33. Sharpe, F. R. & Laws, D. R. J., Journal of the Institute of Brewing. 1981.87,96.

34. Tressl, R., Fricse, L., Fendesack, F. & Kopplcr, H., Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1978, 26,1422.

35. Tressl, R., Fricse, L., Fendesack, F. & Koppler, H., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1978, 26,1426.

36. van den Dool, H. & Kratz, P. D., Journal of Chromatography. 1963,11,463.