Микроскоп в пивоварении (часть 2): эффективное применение

Если вы не читали первую часть статьи по использованию микроскопа в пивоварении, то рекомендуем сначала ознакомиться с ней, чтобы узнать для чего нужен микроскоп в домашнем пивоварении, а также ознакомиться с руководством по его выбору и дополнительным аксессуарам. В этой же части мы предлагаем продолжение перевода статьи: "Microscope use in brewing" , где будет рассказано, как правильно пользоваться микроскопом в пивоварении. Приятного чтения!

 

Использование микроскопа

подготовка образца

Поскольку клетки подсчитываются только в очень маленьком образце, образец должен быть соответствующий пиву или жидкости, содержащей популяцию дрожжей. Это означает, что весь объем необходимо перемешать очень хорошо, и дрожжевым клеткам нельзя позволять флокулировать. Этот момент очень важен.

Существует два подхода для определения уровня засева, т.е. начальной концентрации клеток в пиве. Клетки можно подсчитать, как только они были засеяны в пиве, и клетки могут быть подсчитаны, пока они находятся в сосуде для размножения. Преимущество первого заключается в том, что он не требует разбавления. Но если засеяно больше клеток, чем было необходимо, то они не могут быть удалены. Следующий способ требует разбавление образца. Если количество сусла, добавленного к дрожжам, составляет около 5% от объема сусла, подлежащего засеву (1 л к 20 л партии) рекомендуется разбавление 1:20.

Для этого добавьте 19 мл воды в пробирку или другую небольшую емкость и затем добавьте 1 мл перемешенной дрожжевой культуры. Хорошо все перемешайте, но не трясите их энергично. Некоторые дрожжевые штаммы, в частности элевые дрожжи, любят скапливаться в пене. Повторно втяните образец в пипетку и вытяните его обратно, чтобы промыть пипетку.

дефлокуляция дрожжей

Плохие флокулянты, такие как пыльные дрожжи и немецкие элевые дрожжи, легки в обращение. Большинство других флокулирующих штаммов нуждаются в некоторой помощи. Вот несколько практических способов для дефлокуляции дрожжей во время подсчета клеток.

свежее сусло

Мальтоза ингибирует флокуляцию, потому как дрожжи размножаются в свежем сусле. Это справедливо и для хороших флокулянтов, таких как английские элевые дрожжи (WLP 002). Просто добавьте свежее сусло к дрожжевому осадку и поместите его на магнитную мешалку в течение нескольких минут. Это очень практичный способ определения количества дрожжей в дрожжевых осадках до засева, так как здоровье дрожжей не затрагивается, а дефлокуляция дрожжей также позволит более равномерно распределиться дрожжам по всей поверхности образца.

серная кислота

Когда образец дрожжей подлежащий подсчету не предназначен для засева, то дрожжи могут стать нефлокулентными с добавлением некоторого количества серной кислоты (H₂SO₄ ). Однако, серная кислота является очень едкой и с ней необходимо обращаться осторожно.

динатрий ЭДТУ

Более безопасным, чем серная кислота является ЭДТУ. ЭДТУ (этилендиаминтетрауксусная кислота) представляет собой хелатирующий агент, который хелатирует («захватывает») ионы кальция, необходимые для флокуляции. В результате образец дрожжей не флокулирует. Это не влияет на здоровье дрожжей, а окрашивание метиленовым синим можно использовать для оценки жизнеспособности дрожжей.

PWB

Моющее средство PBW (Powdered Brewery Wash) также содержит хелатообразующие агенты и способна предотвращать флокуляцию дрожжей. В то время оно безопасно в использование и легко доступно для многих пивоваров, но оно влияет на здоровье дрожжей, а окрашивание метиленовым синим не может использоваться для оценки жизнеспособности культуры.

Рисунок 3 - темный гемоцитометр с двумя заполненными счетными сетками. Образец был окрашен метиленовым синем, намного сильнее, чем это необходимо или полезно, чтобы проиллюстрировать, как он всасывается в счетную камеру

подготовка гемоцитометра (счетной камеры)

Подготовьте гемоцитометр в соответствии с инструкциями производителя. В большинстве случаев это означает, что покровное стекло должно находится на счетной сетке (сетках) придерживаясь двумя выступами.

Теперь вытяните образец с помощью пипетки и создайте небольшую каплю на кончике пипетки. Поднесите кончик с каплей прямо рядом с краем покровного стекла, чтобы образец попадал в счетную камеру капелярным способом. Если ваш гемоцитометр имеет две счетные сетки, вытяните еще один образец и повторите процедуру для другой счетной сетки. Образец должен охватывать счетную сетку, избегая переполнения в «канавах» или переполнения по всей поверхности. Слишком много жидкости в канавах может подтолкнуть покровное стекло вверх и изменить объем выше счетной сетки.

Теперь поместите гемоцитометр на предметный столик микроскопа и выберите самое слабое увеличение. С помощью ручки фокусировки подвиньте столик ближе к объективу и, посмотрите в окуляр, сдвиньте столик от объектива до тех пор, пока не увидите счетную сетку. Сфокусируйтесь и перейдите к следующему более высокому уровню увеличения. Повторно сфокусируйте и отрегулируйте положение столика так, чтобы отображалась счетная сетка по центру. Обратите внимание, насколько равномерно распределены клетки. Если они сгруппированы вместе, возможно необходимо будет повторно перемешать образец, или дрожжам потребуется больше времени для дефлокуляции.

Если фокус не нуждается в изменении, его можно оставить как есть, и в следующий раз, когда вы будете считать клетки, вам не потребуется проходить описанную процедуру фокусировки.

подсчет

Измените увеличение на 400-х. Это лучшее увеличение для подсчета дрожжевых клеток. По правилам обычно подсчитываются клетки в 4-х угловых сетках 4x4 и в центральной сетке 4x4 (см. рис. 13 для полной счетной сетки Нойбауэра). Если концентрация дрожжей низкая, возможно, потребуются дополнительные сетки. См. рис. 4, как подсчитывать клетки в одной из сеток 4x4.

При использовании (чаще всего) гемоцитометра с глубиной 0,1 мм концентрация клеток исходного образца в миллионах клеток на мл (или млрд. клеток на литр) составляет:

Рисунок 4 - Когда ведется подсчет количества клеток, то считаются те, которые касаются середины тройных линий сверху и слева от сетки 4x4, но исключаются клетки, касающиеся правой и нижней средней линии. Считайте почкующиеся клетки за две, так как они скоро станут двумя клетками.

Коэффициент разбавления - это соотношение количества образца к объему воды, пошедшей на разбавление, плюс один. Примеры:

• Без разбавления: коэффициент разбавления 0+1=1
• 1 мл образца + 1 мл воды: коэффициент разбавления 1+1=2
• 2 мл образца + 10 мл воды (разбавление 1 : 5+1): значит коэффициент разбавления 6

Формула также обозначает, что подсчет одной строки из 4 маленьких квадратов в неразбавленном образце дает очень грубую оценку плотности клеток.

Количество клеток в культуре в миллиардах можно рассчитать, умножив концентрацию клеток на объем культуры или пива в литрах (1 миллион / мл = 1 миллиард / л). Обратите внимание, что это тот объем, в котором популяция дрожжей в настоящее время приостановлена.

Количество клеток, определенное с помощью гемоцитометра, имеет пределы точности, которые должен понимать каждый пивовар. Ошибка может быть сведена к минимуму если:

• Убедиться, что взятый образец является представителем культуры или пива. Это означает тщательное перемешивание.
• При разбавлении образца его необходимо тщательно перемешать и пипетку необходимо промыть разбавленным образцом.
• Подсчитать достаточное количество клеток. Следует подсчитать не менее 100 клеток, поскольку статистическая ошибка обратно пропорциональна квадратному корню из подсчитанного количества клеток, как показано ниже.

Следующая формула может быть использована для оценки статистической ошибки, основанной на количестве подсчитанных клеток:

В идеале следует брать несколько разных образцов и подсчитывать их отдельно. Если этого не сделано, две счетные камеры должны, по крайней мере, заполняться отдельными пипетками.

Окрашивание метиленовым синим

Окрашивание метиленовым синим позволяет простейшим способом оценить здоровье дрожжевой культуры. Теоретически мертвые клетки окрашиваются в синий цвет, а живые клетки остаются бесцветными. На практике же есть тенденция переоценивать жизнеспособность. Тем не менее, несмотря на свои недостатки, окрашивание метиленовым синим является практически стандартным в пивоваренной промышленности тестом на жизнеспособность благодаря своей простоте и быстрым результатам. Это также удобный тест для домашних пивоваров, поскольку метиленовая синь легко доступна в Интернете и имеет длительный срок хранения.

В окисленной форме метиленовая синь имеет синий цвет. В своей редуцированной форме, называемой лейкометиленовая синь, цвет отсутствует.

Это можно продемонстрировать в «эксперименте с синей бутылкой», где метиленовая синь теряет свой цвет из-за окисления глюкозы и редуцирования метиленового синего. Когда кислород добавляют путем встряхивания, лейкометиленовый синий окисляется до метиленового синего, и синий цвет снова появляется.

 

Эксперимент с синей бутылкой

250 г воды, 4 г гидроксида натрия и 5 г глюкозы (декстроза) смешивают в колбе или стеклянной бутылке. Добавляют 3-5 капель 1% метиленового синего, и раствор становится темно-синим, так как метиленовая синь хранится в его окисленной синей форме.	В среде с высоким рН глюкоза окисляется до глюконовой кислоты. Это потребление кислорода редуцирует метиленовый синий до его бесцветной лейко формы. Реакция занимает несколько минут, и синий слой может оставаться на поверхности, где доступен кислород из воздуха.	Когда кислород добавляется через, например, кислородную палочку лейкометиленовый синий может окисляться до метиленового синего. Это можно увидеть в виде синих полос на фото.	После того, как бутылка сильно встряхивается, в воде растворяется намного больше кислорода, и раствор снова становится темно-синим. Постояв, он снова потеряет свой цвет.

Когда метиленовый синий проникает в живые клетки, дыхание клетки (потребление кислорода) быстро редуцирует его до бесцветной лейкообразной формы. Вот почему живые клетки не окрашиваются. В мертвых клетках метиленовая синь может накапливаться в своей окисленной (синей) форме. Но что, если метиленовый синий не сможет попасть в мертвые клетки. Когда клетка стареет она откладывает липиды и сахара в клеточных стенках с целью защиты от окружающей среды. Это предотвращает проникновение метиленовой сини, и когда клетка позже умирает, она не будет окрашиваться в синий. Если свежую дрожжевую культуру подвергнуть тепловой пастеризации, чтобы убить все дрожжевые клетки, то все клетки будут окрашиваться метиленовым синим (рис. 5). С другой стороны, если старая и мертвая культура дрожжей окрашивается, но не все такие клетки становятся темно-синими (рис. 6). Вот почему окрашивание метиленовым синим переоценивает жизнеспособность культуры по сравнению с подсчетами на агарной пластине, где жизнеспособность клеток оценивается путем подсчета клеток, которые способны расти и образовывать колонии.

Из-за переоценки метиленового синего, результаты менее 85-90% следует рассматривать как непригодными к использованию. В практике пивоварения если культура дрожжей показывает жизнеспособность менее 90%, при тестировании с метиленовой синью, ее не следует использовать и выращивать новую культуру. Этого можно добиться размножением небольшого образца старых дрожжей.

Для проведения теста жизнеспособности с метиленовыми синим пивоварами следует следовать этому руководству:

• приготовьте 1% раствор метиленового синего и оставьте его в бутылке с пипеткой. Он будет вам на запас
• при необходимости разведите образец дрожжей
• добавьте 1 каплю на каждые 5 мл разбавленного образца дрожжей. Капля добавляет объем 0,05-0,07 мл и уменьшает количество клеток на ~ 1%, что явно связано с погрешностью подсчета клеток и, следовательно, можно смело игнорировать.
• позвольте окрашенному образцу постоять 1 минуту
• поместите образец через пипетку в гемоцитометр и смотрите под микроскопом при 400 кратном увеличение

Чтобы правильно видеть какие клетки окрашены, возможно, фокус придется слегка отрегулировать вверх или вниз. Подсчитайте бесцветные и светло-синие / зеленые клетки как жизнеспособные и подсчитайте синие клетки как мертвые. Не считайте синие окрашенные почки клеток, если материнские клетки не окрашиваются. Почки заняты растущим метаболизмом и не могут редуцировать краситель.

Жизнеспособность культуры дрожжей с метиленовой синью может быть рассчитана как:

Рисунок 5 - Культура клеток, пастеризованная и окрашенная метиленовым синим. Все клетки окрашены в синий цвет

Рисунок 6 - Старая культура клеток. Все клетки мертвы, что подтверждается тест на посев в чашке петри. Однако не все клетки были окрашены метиленовым синим. Обратите внимание на удлиненную форму голодных клеток.

Рисунок 7 - Здоровая клеточная культура. Менее 5% окрашиваются метиленовым синим, а клетки имеют круглую форму. Это также пример, когда клетки переполняют счетную сетку, и образец следует разбавлять немного больше

 

подсчет клеток с использованием ImageJ

Подсчет клеток в микроскопе занимает много времени и довольно утомителен. Альтернативой является съемка(и) и подсчет клеток с помощью программного обеспечения подсчета для рабочего стола, такого как ImageJ . Картинки могут быть сделаны с помощью специальной камеры, установленной на микроскоп или даже с камеры сотового телефона, которая удерживается близко к окуляру. Последнее потребует некоторой практики, но работает достаточно хорошо. При съемке для подсчета клеток также можно взять их при уменьшенном увеличении (100x) и, следовательно, в более широком поле зрения. В этом случае единственное изображение должно быть сделано для каждой сетки гемоцитометра.

ImageJ имеет как автоматические, так и ручные режимы подсчета. Для автоматизированного подсчета клеток, основанного на распознавании частиц на изображении, требуется довольно равномерно освещенное изображение высокого качества, которое я не могу снять с помощью мобильного телефона. Из-за этого я использую счетчик клеток в разделе Plugins-> Analyze-> Cell Counter. После установки изображения выбирается тип клеток, и каждый щелчок на изображении оставляет пометку и увеличивает счетчик для этого типа клетки. Различные типы клеток могут использоваться для разных сеток или подсчета окрашенных и неокрашенных клеток.

Рисунок 8 - Снимок экрана ImageJ и подключаемый модуль счетчика клеток. Изображение, на котором подсчитываются клетки, сделано с сотового телефона при 100-кратном увеличении. Она был увеличена, чтобы показать одну из счетных сеток 4x4

Другие виды использования

оценка состояния здоровья дрожжей

Здоровые дрожжевые клетки должны быть упитанные и круглые, в то время как голодные дрожжевые клетки имеют более вытянутую форму похожую на мяч для американского футбола. На Рис. 6 можно увидеть такую старую культуру дрожжей.

элевые против лагерных дрожжей

Рисунок 9 - Элевые дрожжи, демонстрирующие типичную тенденцию к образованию струнных колоний

В целом, вы не сможете различить разные штаммы дрожжей, хотя у некоторых штаммов больше клеток, чем у других. Но есть одна разница между элевыми и лагерными дрожжами, которую иногда можно наблюдать. Элевые дрожжи, как правило, склеиваются после почкования и заканчивают формирование в небольшие струнные колонии, состоящие из 5-10 клеток (см. Рис. 9). Эти колонии часто присоединяются к пузырькам CO2 и поднимаются в верх при брожение. Лагерные дрожжи отделяются после почкования и формируются в группы только при флокуляции. Эти группы представляют собой скопления клеток, а не цепочки.

определение источника помутнений в пиве

Когда в пиве появляется помутнение, имеет смысл взглянуть на его под микроскопом. Процедура такая же, как и для подсчета клеток, за исключением того, что гемоцитометр следует мыть более тщательно, чем обычно, чтобы избежать попадания частиц, которых нет в пиве. Я также советую заполнить одну из сторон гемоцитометра водой, чтобы вы могли сравнить пиво с водой.

Если это не сильная муть, частицы будут довольно далеко друг от друга. Но вы сможете увидеть, является ли мутность результатом дрожжевых или белковых комплексов. Белковые комплексы намного меньше дрожжей (~ 0,5 мкм по сравнению с дрожжами, которые в 10 раз больше). Если мутность является результатом микробной инфекции, она должна быть заметна по вкусу. Бактерии намного меньше дрожжей и обычно имеют форму стержней. Однако не путайте стержнеобразные кристаллы (возможно, моногидрат оксалата кальция) с бактериями. Эти стержни, которые иногда находятся в осадке, примерно такие же, как дрожжевые клетки (см. Рис. 11).

Дрожжевая муть в конечном итоге прекратится. Белковая муть намного упрямее и займет много месяцев, чтобы осесть или нуждается в лечении с помощью оклеивающего агента, такого как желатин.

 

Приложение

Галерея разных изображений в микроскопии

Рисунок 10 - кристалл оксалата кальция, квадратный объект в среднем верхнем квадрате, найденный в осадке бутылки Schneider Weisse

Рисунок 11 - Кристаллы в форме стержня, скорее, моногидрат оксалата кальция, который можно ошибочно принять за бактерии. Но бактерии намного меньше, чем дрожжи.

Рисунок 12 - В центре этого изображения показана холодная частица.

Улучшенная сетка подсчета Нойбауэра

Рисунок 13 - улучшенная сетка подсчета Нойбауэра. 5 зеленых квадратов представляют собой сетки 4x4, которые обычно используются для подсчета дрожжевых клеток.