Добро пожаловать, Гость!
Беер.рф ЗарегистрироватьсяВойти
Menu
Беер.рф
Вступайте в наши соц. группы , чтобы всегда быть в курсе новых событий на сайте

03-03-2021 в 12:47

Лактобактерии в пиве. Часть 2

Просмотров 497, оценка 5.0 из 1, обсуждений 0 | оценить и обсудить

От переводчика: Перевод материалов сайта MTF о лактобактериях. Статья была поделена на три части. В первой части были расмотренны классификация и характеристики, а также комерческие культуры лактобактерий. Во второй части обшие советы по размножению, нормам засева, росту клеток, хранению и влиянию лактобактерий на смешанное брожение. А в третьей, заключительной части, рассмотрим брожение лактобактерий: изменение ph, метаболизм, потребление сахаров, проблемы с пенообразованием и т.д.

Приятного чтения!

 

Общие советы

Стартеры и нормы засева

В дополнение к информации о стартерах, приведенной выше в разделе «Советы производителя»  (в первой части статьи), в этом разделе содержатся общие рекомендации по стартерам для Lactobacillus для домашних и коммерческих пивоваров. Для выращивания Lactobacillus в лабораторных условиях или из исходной группы клеток из чашки/уклона или меньшего количества клеток наиболее эффективной средой для выращивания является MRS (https://ru.qaz.wiki/wiki/MRS_agar) . Однако для полноценной нормы внесения Lactobacillus в пиво/сусло пивовары не захотят добавлять такое количество MRS в свое пиво, поскольку среда MRS имеет отчетливый аромата и запах, которые нежелательны для пива. Таким образом, размножение Lactobacillus в стартере на основе сусла рекомендуется для создания полноценных Lactobacillus. Мы рекомендуем использовать колбу Эрленмейера, предназначенную для выращивания Lactobacillus, чтобы снизить вероятность заражения дрожжами. Мы также рекомендуем использовать процедуры Самуэля Эшлиманна (см. ниже). Дополнительно смотрите External Resources.

Хорошая норма засева для Lactobacillus составляет 100-125 миллиардов клеток на 5 галлонов сусла, хотя нормы засева для Lactobacillus не так важны, как для дрожжей. Имея руководства производителя по подсчету клеток или выполняя подсчет клеток вручную сразу после роста клеток в стартере, а затем засевая точно такое же количество клеток в сусло – лучший подход для определения нормы внесения. Однако подсчет клеток Lactobacillus под микроскопом может быть затруднен из-за небольшого размера клеток, поэтому вместо подсчета клеток обычно говорят про объемы стартера, когда речь идет о нормах внесения Lactobacillus. Общая рекомендация - внесение ~ 0,5-1 литра на ~ 20 литров сусла (~ 0,75-1 галлона на баррель) стартера Lactobacillus (см. ниже). Обратите внимание, что точные рекомендованные объемы стартера коммерческих культур могут отличаться от производителя к производителю, и их рекомендации могут отличаться от наших. Достижение точных норм засева для Lactobacillus, как правило, не является необходимым, потому что чрезмерный засев не оказывает отрицательного воздействия, а недостаточный засев также менее проблематичен, чем недостаточный засев дрожжей (при недостаточном засеве есть риск, что лактобактерии произведут меньше кислоты, чем должны произвести определённые виды Lactobacillus) . По этим причинам, а также из-за сложности оценки количества клеток (тип стартовой среды, штамма и других переменных), калькулятор нормы засева для Lactobacillus в настоящее время не существует. Однако расчеты, основанные на объеме стартера и свежести, должны быть близкими к истине.

Степень роста, которая происходит в стартере, сильно варьируется в зависимости от типа среды стартера, и фактическое количестве клеток неизвестно, за исключением случаев, если пивовар все же может подсчитать клетки. Мэтт Миллер из Sour Beer Blog и Ричард Прейсс из Escarpment Yeast Labs советуют, что если возможно достигнуть идеального роста (1-2 миллиарда клеток / мл) (например, с помощью процедуры Самуэля Эшлиманна или среды MRS), то внесение всего 100 -125 мл свежего стартера Lactobacillus на 5 галлонов пива поможет достичь желаемой кислотности в течение 24 часов. По словам Мэтта, умеренно хороший рост в стартере дает около 500 миллионов клеток/мл, что дает 400 мл стартера на 5 галлонов, а низкий рост дает около 100 миллионов клеток/мл, в результате чего необходимо использовать 2 литра закваски на 5 галлонов (подробнее см. Matt Miller's article). Если степень роста не может быть точно определена путем подсчета клеток под микроскопом, то внесение 0,5–1 литра свежего стартера Lactobacillus на 5 галлонов сусла гарантирует, что будет внесено адекватное количество клеток.

Еще одна вещь, которую следует учесть: рекомендуется как можно быстрее достичь pH 4, чтобы предотвратить неприятные запахи от возможной контаминации микробами. Большая норма внесения культуры позволит быстрее опустить уровень pH. Поэтому, если не используется процедура подготовки стартера Самуэля Эшлиманна, рекомендуется вносить 0,5-1 литр закваски на 5 галлонов сусла. Даже при использовании процедуры Самуэля Эшлиманна чрезмерный засев Lactobacillus не должен вызывать беспокойства, поэтому не лишним будет подумать о той же норме внесения 0,5–1 литра на 5 галлонов, если только пивовар не уверен точно, что в стартере достигнута высокая скорость роста культуры, в этом случае 100-125 мл на 5 галлонов сусла / пива должно быть достаточно (опять же, точные нормы засева для Lactobacillus, как правило, не так важны, как нормы засева дрожжей). Другими факторами, которые могут повлиять на эффективность стартера, рассчитанного по объему, являются вид/штамм используемой Lactobacillus, степень контаминации дрожжами и возраст стартера Lactobacillus. Для некоторых видов/штаммов может потребоваться больший объем закваски, а также он потребуется, если дрожжи загрязнили стартер или сусло (см. 100% Lactobacillus Fermentation). Если культура Lactobacillus старше 1 месяца, следует приготовить новый стартер. Хранение отдельной колбы Эрленмейера для стартера Lactobacillus может помочь предотвратить заражение дрожжами, а также использование стерилизационного оборудования, такого как автоклав или скороварка.

Стартовые среды, которые используют пивовары, включают стартеры с DME и стартеры из яблочного сока. Они подходят для многих пивоваров. Однако Самуэль Эшлиманн из Eureka Brewing Blog показал, что использование DME с небольшим количеством яблочного сока, мела и дрожжевых питательных веществ обеспечивает близкую к оптимальной плотность клеток, которая соответствует плотности клеток на среде MRS. Конкретные питательные вещества, которые увеличивают рост клеток, - это тиамин (витамин B1) или комбинация тиамина и рибофлавина (витамин B2). Например, было показано, что тиамин необходим для того, чтобы L. brevis эффективно превращали пируват в молочную кислоту и этанол. Добавление этих питательных веществ может способствовать росту клеток. Например, было обнаружено, что добавление витамина H (биотина) значительно увеличивает рост L. plantarum в лабораторных условиях.

Для окончательного вывода, потребуется больше экспериментов, но перемешивание считается важным фактором роста как для дрожжей, так и для бактерий в целом. Небольшое перемешивание на магнитной мешалке или орбитальном шейкере, или частое осторожное перемешивание вручную приводит к более быстрому росту и большему количества организмов. Перемешивание позволяет микробам находится во взвеси в растворе. Это также увеличивает доступ микробов к питательным веществам и равномерно распределяет отходы. В не перемешиваемом стартере микробы ограничены скоростью диффузии питательных веществ, что приводит к более медленному и более стрессовому росту. Если перемешивание невозможно по какой-либо причине, успешный стартер можно приготовить без перемешивания. Sam Aeschlimann сообщил о хороших успехах при использовании стартеров Lactobacillus, которые не перемешивались.

Хотя Lactobacillus толерантны к кислороду, кислород обычно не влияет отрицательно на их рост (за исключением L. plantarum, который, как было показано, вырабатывает небольшое количество уксусной кислоты в присутствии кислорода и отсутствии глюкозы), таким образом обычно кислород не нужен (исключением может быть L. brevis, который, как было показано, немного увеличивает скорость роста в присутствии кислорода). Поэтому, как правило, лучше не допускать контакта стартера Lactobacillus с кислородом, используя гидрозатворы и пр. Если происходит контакт с воздухом, но стартер не пахнет так, как будто он был контаминирован, то стартер можно использовать.

Неправильно высушенные Lactobacillus могут вызвать густой осадок в стартовых средах. См. this advice from Mark Riester.

Для получения информации о стартере для смешанных культур см. Mixed Culture Starters

Визуальное сравнение роста Lactobacillus с CaCO3 и без CaCO3; фото предоставлено Джеффом Мелло из Bootleg Biology. См. this page для получения подробной информации об этом изображении.

Подготовка стартера по методу Самуэля Эшлиманна

Самуэль Эшлиманн из Eureka Brewing Blog (см. Samuel Aeschlimann from Eureka Brewing Blog) провел серию экспериментов, в ходе которых был найден рецепт стартера на основе DME, который дает очень высокую плотность клеток, аналогичную плотности среды MRS, что обеспечивает оптимальную скорость роста Lactobacillus. Рецепт этого стартера: 1.040 SG (10P) сусло DME с 10% яблочного сока + 1,5-2 грамма мела (CaCO3) на литр + питательные вещества для дрожжей (первоначально Эшлиман рекомендовал 20 граммов мела, но теперь мы рекомендуем гораздо меньшее количество мела; подробности см. ниже). Это стартер может быть столь же эффективным без добавления 10% яблочного сока, но, насколько нам известно, подтверждений этому нет. Что касается использования мела, то это наилучший буфер, потому что он не реагирует с CO2 по сравнению с чем-то вроде пищевой соды, поэтому он не будет распадаться при взаимодействии с воздухом или из-за производства CO2 лактобактериями. Он также имеет pKa (максимальная буферная емкость) около 4,6, что идеально для роста Lactobacillus. Тот факт, что он легко осаждается, также делает его идеальным для использования в качестве буфера. Джефф Мелло из Bootleg Biology, Ник Импеллиттери из The Yeast Bay и Брайан из блога Sui Generis предполагают, что использование меньшего количества CaCO3 в количестве 1,5-2 грамма на литр предпочтительнее, потому что такое количество легче выпадает в осадок и достаточно легко не допустить его попадания в пиво (хотя различия в росте от меньшего количества мела не проверялись). Чтобы создать 1-литровую закваску для 20 литров сусла, следуйте этим инструкциям:

  1. Добавьте 100 граммов DME примерно в 900 мл воды и пастеризуйте/кипятите, как обычно для стартера. Должно получиться сусло с плотностью 1,040 SG (10P).
  2. Охладите сусло DME до желаемой температуры инкубации (см. п. 4) и добавьте 100 мл пастеризованного яблочного сока, 1,5-2 грамма мела (CaCO3) и половину чайной ложки питательных веществ для дрожжей. Мел не растворяется в растворе, так что не беспокойтесь об этом. Кипячение яблочного сока может разрушить некоторые питательные вещества, находящиеся в нем, которые помогают Lactobacillus в их росте, и, поскольку он пастеризованный, в кипячении нет необходимости.
  3. Лучше всего не аэрировать стартер, хотя для L. brevis может быть исключение. Некоторые люди предпочитают перемешивать стартер закрывая сосуд воздушной пробкой (гидрозатвором), чтобы бактерии оставались во взвешенном состоянии, другие не используют перемешивание и держат стартер неподвижным. Перемешивание может улучшить скорость роста за счет равномерного распределения отходов и питательных веществ. Одно из преимуществ отказа от мешалки, по крайней мере, до тех пор, пока пивовар не ознакомится со своей культурой, состоит в том, что верхняя часть стартера начнет очищаться, когда стартер будет сброжен/готов.
  4. Стартер следует держать при температуре, наилучшим образом подходящей для выращивания культуры, как указано в таблице по характеристикам культур (см. выше).
  5. Обратитесь к приведенным выше таблицам культур, чтобы узнать, как долго следует инкубировать стартер перед внесением (24–48 часов - общее правило). Если магнитная мешалка не используется, одним из признаков того, что стартер готов, будет то, что верхняя часть стартера начнет очищаться (мутность - показатель того, что культура растет, и как только верхняя часть стартера начинает очищаться, то это является признаком остановки роста).
  6. Мел нежелательно добавлять в пиво из-за его буферного эффекта. Мел осаждается в течение нескольких часов после добавления в стартер или, если используется мешалка, через пару часов после ее выключения. Lactobacillus должна оставаться во взвешенном состоянии в течение как минимум одного или двух дней после того, как стартер будет готов, поэтому перемешивание стартера не требуется, хотя это, безусловно, одна из опций. Если стартер взболтался, подождите пару часов, чтобы мел снова выпал. После того, как мел осядет на дно колбы, вылейте всю жидкость из верхней части стартера в сусло/пиво и оставьте осадок мела. Не делайте колдкраш для стартера, поскольку это может отрицательно сказаться на здоровье бактерий.

Модифицированные версии

  • Микробиолог доктор Мэтт Хамбард использует модифицированную версию вышеупомянутого рецепта: смешайте 10% яблочного сока (без консервантов) с суслом 1,010 SG и столовой ложкой карбоната кальция на каждый галлон. Делайте стартер в течение 2 дней при температуре ~ 90F (32С), а затем охладите до температуры холодильника и храните в холодном состоянии до готовности к использованию (засевать в холодном виде - это нормально). Чтобы поддерживать культуру в течение длительного времени, каждые ~ 4 недели перемешивайте культуру, возьмите 10-15% жидкой культуры и добавьте ее в новую партию стартера и выращивайте новый стартер в течение 2 дней, как было указано ранее. До тех пор, пока дрожжи не загрязнят процесс, молочнокислые бактерии при таком методе могут сохраняться неограниченно долго.
  • Ник Импеллиттери из The Yeast Bay поделился своим составом 1-литрового стартера: 25 г декстрозы, 10 г Fermaid O (подкормка для дрожжей), 2,5г CaCO3, 100 мл яблочного сока (без консервантов), 20 мл томатного сока (без консервантов), 1 мл Твин 80; довести деионизированной водой до 1 л; pH ~ 6,2-6,3.

Смотрите также: 

 

Рост клеток

«Обычно я выращиваю их в анаэробных условиях в среде MRS (см. MRS media). Кажется, что она работает очень хорошо и дает хороший рост. Лично я добился наибольшего успеха в среде MRS (только для культивирования из замороженных запасов культур; MRS не подходит для культивирования из пищевых продуктов, и полученные побочные продукты следует декантировать или гранулировать; MRS не следует использовать для крупномасштабного размножения) и в анаэробной среде, хотя я знаю, что некоторые штаммы Lactobacillus отлично растут в аэробных условиях. Проблема роста лактобактерий состоит в производстве ими молочной кислоты, которая начинает угнетать их собственный рост. MRS содержит буфер, который помогает бороться с падением pH из-за метаболизма LAB, буфер поддерживает pH около 6-6,5 (я так думаю) для их оптимального роста. Я обычно культивирую их при 35 C, но иногда в инкубаторе нет места (как сейчас), и я просто использую магнитную мешалку с воздушным затвором», - Ник Импеллиттери из The Yeast Bay об общем росте клеток Lactobacillus.

 Максимальная плотность клеток Pediococcus и Lactobacillus составляет около 1-9 миллиардов клеток/мл, в зависимости от доступных питательных веществ (аминокислот и свободного аминного азота / FAN) в питательной среде. Темпы роста клеток совпадают с падением pH и повышением титруемой кислотности. Было доказано, что пивное сусло является нормальной питательной средой для выращивания Lactobacillus. Как рост, так и снижение pH начинают стабилизироваться примерно через 12-48 часов (при условии, что совместно с Lactobacillus нет дрожжей, с которыми нужно было бы конкурировать). Титруемая кислотность также резко возрастет во время роста, но также будет продолжать расти после завершения роста. Максимальный рост, на который способен конкретный вид или штамм, можно объяснить его толерантностью к pH и, следовательно, его способностью производить больше кислоты. Например, было показано, что L. plantarum растет в среде с очень низким pH (3,37–3,0 pH, в зависимости от штамма) из-за их способности лучше контролировать большие градиенты pH между цитоплазмой и внешней средой. Это было доказано в приведенных выше данных Мэтта Хамбарда (см. above data provided by Matt Humbard). Магистерская диссертация Томаса Хюббе показала, что у штамма L. brevis наблюдался всплеск роста через 50 часов, а затем небольшой спад в количестве клеток через 96 часов, после чего количество клеток оставалось неизменным в течение как минимум 528 часов.

Влияние на рост клеток в смешанных культурах, см. Effects of Mixed Cultures on Growth.

 

Влияние кислорода

Все прокариоты, включая все бактерии, классифицируются в зависимости от уровня кислорода, при котором они могут расти, и того, как они используют кислород, если вообще используют. Виды Lactobacillus обычно считаются «факультативными анаэробами» (или «факультативными аэробами»), однако они представляют особый случай. Факультативные анаэробы обычно получают энергию из кислорода, если он присутствует, через путь окислительного фосфорилирования, но в остальном участвуют в анаэробной ферментации. Виды Lactobacillus могут использовать кислород, но не путем окислительного фосфорилирования. Вместо этого они используют альтернативный путь. В таком случае используются флавинсодержащие оксидазы и пероксидазы для окисления NADH2 с помощью O2. Таким образом, лактобактерии уникальны тем, что стирают грань между факультативными анаэробами и другим классом прокариот, известным как «аэротолерантные анаэробы». Аэротолерантные анаэробы не используют кислород для выработки энергии, но могут расти в присутствии кислорода.

Важный вывод заключается в том, что кислород не оказывает значительного влияния на большинство видов Lactobacillus. Им безразлично, присутствует ли кислород для их собственного роста и производства энергии и молочной кислоты для пивоваров. Они также не производят значительного количества масляной кислоты или изовалериановой кислоты в присутствии кислорода.

Хотя, скорее всего, это не имеет отношения к пивоварению, в научной литературе можно найти несколько исключений. Например, L. plantarum, который является факультативно гетероферментативным видом, в отсутствии кислорода становится гомолактическим (Примечание переводчика: т.е. в таком варианте ферментации одна молекула глюкозы превращается в две молекулы молочной кислоты, т.е. штамм продуцирует только молочную кислоту без кислорода и этанола) и продуцирует только молочную кислоту. Однако после того, как источники питания исчерпаны, в присутствии кислорода L. plantarum переключается на гетеролактическую ферментацию и далее превращает молочную кислоту в уксусную кислоту. В лабораторных условиях преобразование молочной кислоты в уксусную кислоту происходило только в отсутствии глюкозы (это может не работать в пивном сусле, где другие ограничивающие факторы, такие как низкий pH, могут помешать L. plantarum продолжить свои метаболические процессы до того, как вся глюкоза будет ферментирована, т.е. сходные условия имеют при закислении в котле), и только во время стационарной фазы (после прекращения роста). Во время преобразования молочной кислоты в уксусную кислоту L. plantarum также продуцирует перекись водорода (H2O2), которая токсична для микроорганизмов и считается механизмом защиты L. plantarum. Тот же самый процесс наблюдался также у одного штамма L. brevis и в аналогичных условиях обеднения питательных веществ и кислорода. Важно понимать, что эти результаты были получены в лабораторных условиях и без какой-либо цели для пивоварения, поэтому не следует считать, что эти процессы важны для пивоварения. Omega Yeast Labs сообщает, что заметного образования уксусной кислоты не происходит, если кислород присутствует при засеве их смеси OYL-605 Lactobacillus, содержащей L. plantarum; пивовару не стоит аэрировать сусло во время закисления, но и специально избавляться от O2 не требуется. Таким образом, образование уксусной кислоты и перекиси водорода в типичных условиях пивоварения, когда присутствует мало кислорода или он отсутствует, вероятно, не должно вызывать беспокойства. Даже если Lactobacillus не погибнет при повторном кипячении, рекомендуется проводить аэрирование для работы дрожжей, особенно если пивовар полагается на один штамм пивных дрожжей для завершения ферментации. См. «Aeration for Mixed Fermentation». В некоторых случаях кислород может принести пользу некоторым видам. Например, было доказано, что один штамм L. brevis увеличивает скорость роста в присутствии кислорода. Магистерская диссертация Томаса Хюббе показала, что в лабораторных питательных средах «VLB-S7-S», «NBB®-A» и MYPG + циклогексимид оба протестированных штамма Lactobacillus (L. brevis и L. parabrevis) не показали роста в аэробной камере, но выросли в анаэробной камере, хотя это может быть эффектом той среды для культивирования, и не характерно для условий пивоварения. Смотрите также: Kettle souring.

 

Толерантность к хмелю

Ниже приведены комментарии Брайана из блога Sui Generis Brewing (см. Sui Generis Brewing blog):

Существует немало исследований о толерантности к хмелю; это непростая тема, так как на устойчивость к хмелю влияет ряд факторов. Чтобы еще больше усложнить ситуацию, толерантность к хмелю является индуцируемым признаком многих видов Lactobacillus, а это означает, что кажущийся восприимчивым к хмелю штамм может стать устойчивым при культивировании во все возрастающих дозах, а кажущийся устойчивым штамм может стать восприимчивым через одно или четыре поколения в период выращивания в безхмелевых средах.

Я уже несколько месяцев пытаюсь создать лакто-штамм с постоянной устойчивостью к высоким альфа-кислотам. Я культивировал L. brevis в увеличивающемся количестве сусла IBU (начиная с 10, в настоящее время с 25). Каждое 4-е поколение (1 поколение = субкультура лакто-культуры в стационарной фазе, а не количество делений клеток) я прохожу через 2 поколения среды без IBU, чтобы попытаться отобрать штаммы, которые поддерживают эту устойчивость. Похоже, что это сработало до ~ 18 IBU (обновлено: 20-30 IBU), но после этой точки сопротивление остается индуцируемым. Я надеюсь, что еще несколько поколений дадут мне стабильно устойчивый сорт. Обновление: я сделал крепкое (~ 80 IBU) сусло, которое я разбавил неохмеленным суслом. Я выращивал Lactobacillus в течение нескольких пассажей (1 пассаж = выращивание культуры до завершения, затем разбавлял ~ 1: 100 в свежем сусле для начала следующего пассажа) на заданном уровне IBU, затем переходил к суслу на 3 или около того IBU выше. Я тренировался 50-60 поколений, прежде чем достиг высокого уровня IBU (~ 3 месяца, 1-2 дня на поколение). Я никогда ничего не делал, чтобы определить, какая часть этого сопротивления передалась по наследству. Есть и другие варианты;

Я очистил (но не сохранил - ох) некоторые довольно устойчивые штаммы из зерна, сделав чашки, на которых вы наполовину наполняете тарелку под углом суслом с высоким IBU, а затем накладываете на это сусло без IBU. Это дает вам градиентную пластину с низким IBU на конце, где слой охмеленного сусла самый тонкий, и с высоким IBU там, где он самый толстый. Некоторые из этих штаммов были устойчивы к более чем 30IBU, но, когда я только начинал заниматься выращиванием дрожжей, я не стал их хранить.

Хмель содержит множество соединений, которые обладают бактериостатическим действием. Альфа-кислоты являются наиболее изученными, но было обнаружено, что другие соединения, такие как бета-кислоты, ряд полифенолов (например, ксантогумол) и даже некоторые ароматические масла (например, гумулен), оказывают некоторое ингибирующее действие на лактобациллы. Более поздние соединения (особенно бета-кислоты) являются причиной того, что выдержанный хмель сохраняет ингибирующие свойства несмотря на то, что он почти лишен альфа-кислот. Во всех случаях эти соединения, по-видимому, одинаково подавляют бактерии - все эти соединения содержат довольно большие плоские гидрофобные области. Этим областям не «нравится» находиться в воде, и поэтому они будут попадать в гидрофобное ядро бактериальной плазматической мембраны. Это открывает крохотные отверстия в мембране, которые не позволяют бактериям поддерживать ионный (в частности, протонный) градиент, что приводит к подавлению роста и даже гибели бактерий.

Устойчивость к хмелю обычно возникает из-за индуцированной экспрессии генов «транспорта лекарственных средств» (MDT), которые представляют собой «насосы», которые распознают общую химическую сигнатуру соединений, разрушающих мембрану, а затем выкачивают их из клетки. Могут быть задействованы и другие механизмы - в нескольких работах были выявлены изменения в липидном составе плазматической мембраны, которые могут повысить стабильность. Этм изменения также происходят также в отношении алкоголя (для улучшения стабильности), поэтому неясно, имеет ли конкретное изменение какое-либо отношение к устойчивости к хмелю.

У лактобактерий обычно нет этих генов MDT, поэтому многие штаммы не справятся с хмелем в первой партии пива, но со временем становятся все более и более толерантными, поскольку они увеличивают экспрессию MDT. Общий уровень экспрессии MDT, теоретически, определяет максимальную устойчивость бактерий. В случае моих экспериментов я ищу мутантов, чьи MDT постоянно «включены» для устойчивого штамма и «выключены» для чувствительного штамма.

Устойчивость к хмелю зависит не только от вида, но и от штамма. Например, в диссертации Ф. Дж. Метнера было измерено падение pH сусла, которое началось при pH 5,55 с 3 по 14 день для нескольких штаммов L. brevis с разными уровнями IBU (7,9,11,13 и 18 IBU). Один штамм L. brevis в конечном итоге снизил до 3,8 pH на 14-й день с 7 IBU, а другой штамм снизился до 3,3 pH на 14-й день (с другими штаммами, находящимися между этими значениями). При 18 IBU pH у относительно непереносимого к хмелю штамма L. brevis снизился до 4,2, а у другого штамма - до 3,7. Как правило, чем выше IBU, тем медленнее падает pH. Интересно, что другой вид под названием L. coryniformis оказался более устойчивым к хмелю, чем L. brevis. L. coryniformis снизил pH сусла 18 IBU до 3,6 за 14 дней.

Данные Метнера представлены ниже; графики, созданны Бенедиктом Кохом. Ось Y = pH, ось X = дни.

L70: L. coryniformis

L14, L18, L22, L29, L88, L92: L. Brevis


7IBU

9IBU

11IBU

13IBU

18IBU

Смотрите также:

Hops Antimicrobial Properties and Dry Hopping Inhibits Lactobacillus.

How hops prevent infection, by Lars Garshol.

Per Buer's Video Demonstration of how dry hopping inhibits Lactobacillus.

Толерантность к другим видам растений

Другие виды растений также могут подавлять рост Lactobacillus. В магистерской диссертации Нади Марлен Осен из Норвежского университета естественных наук сообщается, что веточки Juniperus communis (можжевельник обыкновенной) оказывают значительное влияние на рост Lactobacillus. Испытываемые виды: L. plantarum, L. brevis и L. buchneri. Индивидуальные настои можжевельника в воде были приготовлены с использованием веточек, хвои, спелых ягод и незрелых ягод, и настои измеряли в граммах растительного материала на мл воды. Настои можжевельника широко распространены в фермерском пивоварении, а в Норвегии их называют einerlog. Ветки можжевельника, настоянные на воде, оказали наибольшее влияние на рост тестируемых видов молочнокислых бактерий, при этом L. plantarum частично подавлялись при концентрации около 0,031–1 г / мл. L. brevis частично подавлялась при 0,5–1,0 г / мл, а L. buchneri подавлялась при 0,125–1 г/мл. Хвоя можжевельника оказала очень ограниченное влияние на основе тестируемых концентраций (до 1 г / мл). Незрелые ягоды оказали очень незначительное влияние, а спелые ягоды вообще не оказали значительного влияния на рост Lactobacillus. Никаких дополнительных исследований не проводилось, чтобы определить, какие компоненты в веточках можжевельника ингибируют LAB, или каковы их концентрации.

 

Толерантность к алкоголю и сахару

Лактобактерии обычно толерантны к алкоголю и высоким уровням сахара (хотя их рост замедляется, когда содержание сахара превышает 20%, из-за осмотического давление, воздействующего на клеточную стенку). В присутствии большого количества этанола устойчивые к алкоголю штаммы заполняют свои клеточные стенки жирными кислотами, что замедляет проникаемость клеточной мембраны. Толерантность Lactobacillus к алкоголю зависит как от штамма, так и от среды для выращивания, причем толерантность к алкоголю обычно выше, когда им доступны глюкоза или крахмал. В одном исследовании, в котором изучался 31 штамм Lactobacillus, все штаммы эффективно росли при крепости 4%. Все они по-прежнему росли при крепости 10%, хотя некоторые штаммы показывали трудности в нормальном росте при крепости 10%. В целом рост замедлялся при крепости 12% (и несколько штаммов с непереносимостью алкоголя перестали расти), но у большинства все же наблюдался некоторый рост. Восемь из протестированных штаммов все еще были способны демонстрировать значительный рост при крепости 16%, и в целом большинство штаммов были способны демонстрировать хотя бы небольшой рост при крепости 16% (в большей степени при наличии крахмала и глюкозы, чем целлобиозы, лактозы или ксилозы) . В целом, виды, которые были менее устойчивы к высоким количествам этанола (10-16%), из которых: L. amylovorous (1 из 4 штаммов был особенно нетерпимым), L. hilgardii (1 штамм все еще рос с крепостью 16%, но меньше, чем другие), L. pentosus (1 штамм все еще рос в крахмальной среде, но не в глюкозной выше 10% ABV) и L. casei (большинство штаммов росли на большинстве питательных сред, но обычно меньше, чем другие виды). В целом, штаммы L. brevis и L. plantarum были более устойчивы к высоким концентрациям ABV.

Peyer et al. (2017) изучили влияние содержания сахара в пивном сусле на штамм Lactobacillus amylovorous. Они обнаружил, что более высокая плотность сусла увеличивает рост Lactobacillus, а следовательно, и производство молочной кислоты. Это увеличение было линейным до тех пор, пока экстракт не достиг 16 Brix (1.065 SG), после чего увеличение роста стало замедляться. Более высокий рост и большее производство молочной кислоты в сусле с более высокой плотностью, вероятно, были связаны с увеличением количества питательных веществ, а также с более высокой буферностью. Такое увеличение роста в высокоплотном сусле останавливалось при достижении 18-20 Брикс, что, вероятно, было связано с осмотическим стрессом на клетки.

 

Устойчивость к экстремальным температурам

У большинства видов Lactobacillus термическая смерть наступает при ~ 145 ° F (63 ° C). Замораживание без глицерина убьет большинство клеток, но очень небольшое количество устойчивых к холоду мутантов могут выжить (~ 1: 19: 00). В очень редких случаях некоторые штаммы были идентифицированы как чрезвычайно термотолерантные. Например, в этом патенте (см. this patent) утверждается, что штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis может подкислять молоко в течение 2,5 часов при температуре 45–65 ° C (113–149 ° F).

 

Хранение

Крупные лаборатории часто хранят бактерии в лабораторном морозильнике с температурой -80C в растворе среды/глицерина (любая стандартная среда и 20-50% глицерина), однако этот вариант, как правило, непрактичен для пивоваров. Что касается высушенных Lactobacillus, таких как пробиотики или сухие дрожжи для кислых элей BlackManYeast, Брайан в своем блоге (см Bryan of Sui Generis Blog's) заявляет, что лабораторные исследования показали, что они могут терять жизнеспособность примерно в 80 раз быстрее при комнатной температуре, чем при хранении в холоде. Поэтому рекомендуется хранить высушенные Lactobacillus при низких температурах. Кратковременное хранение жидких культур (менее 2 месяцев) также следует осуществлять в холодильнике. Прежде чем использовать несвежую культуру, подумайте о приготовлении стартера.

Жидкие культуры подвергаются стрессу из-за двух факторов: хранения в кислой среде и хранения без сахара. Хранение с сахаром создаст больше кислоты, поскольку Lactobacillus ферментирует сахар и производит кислоту, поэтому это может быть не самым идеальным вариантом несмотря на то, что Lactobacillus будут постоянно питаться. В идеале для более длительного хранения жидкие культуры Lactobacillus следует хранить замороженными с добавлением 20% глицерина или охлажденными на откосах с водой или минеральным маслом. Кроме того, существуют неофициальные данные о том, что некоторые виды могут лучше выжить при комнатной температуре. Брайан предполагает, что стабильная температура может быть более важной, чем хранение при «идеальной» температуре. Инструкции о том, как сделать откосы в домашних условиях, способные хранить любой микроб потенциально более 2 лет (требуется скороварка), можно найти здесь  (see Bryan video on Sui Generis Brewing (requires a pressure cooker)).

Практический вариант для пивоваров без скороварки - хранить жидкую культуру с несколькими граммами буферного химического вещества, такого как карбонат кальция (мел) или гидроксид кальция (травильная известь). Точное количество должно быть скорректировано для достижения pH примерно 4,0-6,0 для всего раствора (начните с 1 или 2 граммов на литр и при необходимости отрегулируйте).

Том Бельграно предлагает следующие дополнительные шаги для удаления остаточного сахара из раствора для хранения, а также для повышения pH:

  1. Сделайте колд краш, пока сусло не станет прозрачным.
  2. Слейте жидкость, а затем долейте ее водой (рекомендуется дистиллированной, но не обязательно).
  3. Снова сделайте колдкраш, пока жидкость не станет прозрачной.
  4. Слейте жидкость.
  5. Храните полученную суспензию при температуре холодильника. Небольшое понижение pH все же может произойти, но этот метод должен поддерживать pH раствора значительно выше 4,0.

Коммерческие пивовары, которые пытаются повторно использовать чистые культуры Lactobacillus для закисления в котле, часто сливают часть закисшего сусла перед его кипячением. Сусло с живыми Lactobacillus сохраняется для дальнейшего использования в будущих партиях. Вероятно, предпочтительнее холодное хранение. Этот метод может иметь свои сложности, т.к. остаточный сахар в сусле может легко привести к дрожжевому или иному загрязнения (см. 100% Lactobacillus fermentation). Хранение забуференного сусла в анаэробных условиях с pH выше 4,5 может потенциально привести к образованию ботулотоксина (Примечание переводчика: сильнейший органический яд) (см. this Beer and Wine Journal article by Dr. Chris Colby). Автоклавирование, тиндализация или приготовление под давлением сусла перед добавлением в него культуры Lactobacillus обеспечили бы стерильную среду, свободную от потенциальных спор ботулизма, но это может оказаться непрактичным процессом для пивовара. Можно достичь pH в районе 4,0-4,5, используя CaCO3 (мел) для буферизации pH в диапазоне, который увеличивает жизнеспособность Lactobacillus, а также делает сусло безопасным для хранения (для этого требуется больше данных в отношении необходимого количества CaCO3). Использование мела в качестве буфера аналогично использованию метода приготовления стартера по методу Самуэля Эшлиманна, описанного выше; мел должен осесть на дно емкости, и его можно будет слить.

Смотрите также:

Марк Рейстер подробно описывает некоторые подходы к использованию лиопротекторов для сушки Lactobacillus (Mark Reister details some approaches to using lyoprotectants to dry Lactobacillus.)

 

Выращивание на агаре

Виды Lactobacillus можно вывести на чашках с агаром с помощью селективной среды, называемой Rogosa SL. Агар Rogosa SL содержит цитрат аммония, ацетат натрия, относительно низкий pH и уксусную кислоту, которые выделяют Lactobacillus, одновременно подавляя плесень и другие бактерии. Однако сама по себе эта среда не подавляет дрожжи. Если требуется подавление дрожжей, добавьте 10 мг/л циклогексимида для подавления большинства дрожжей.

См. Rogosa SL Agar (Lactobacillus); Basement Brew Lab, by Dustin, чтобы узнать больше.

 

Влияние на смешанное брожение

Lactobacillus могут влиять на метаболизм S. cerevisiae и производимые ими метаболиты, отвечающие за ароматы. В исследовании Dysvik et al. (2019) сравнили пиво, предварительно закисленное L buchneri, с пивом предварительно закисленным молочной кислотой, и с пивом, в которое добавили молочную кислоту после основного брожения дрожжей, и обнаружили, что молочная кислота сама по себе существенно не изменяет количество летучих ароматических соединений, продуцируемых тестируемым штаммом дрожжей. (Fermentis US-05). Тем не менее, пиво, закисленное с помощью L. buchneri, содержало летучие спирты, значительно отличающиеся от пива, в которое была добавлена только молочная кислота. В частности, пиво, которое было предварительно закислено L. buchneri, в итоге содержало меньше 2-метил-1-бутанола (алкоголь, солодовые нотки), 2-метил-1-пропанол (фруктовый/винный) и фенилэтилового спирта (роза/мед). Уксусная кислота также была намного выше в пиве, закисленном L. buchneri, по сравнению с пивом с добавлением только молочной кислоты, но уксусная кислота все еще была ниже вкусового восприятия. Муравьиной кислоты было примерно в два раза больше в сусле, закисленном L. buchneri, чем в сусле с молочной кислотой или без молочной кислоты/бактерий, но муравьиная кислота полностью исчезла во всех тестируемых сортах пива во время розлива и после созревания в бутылке. Хотя в этом исследовании использовались нейтральные элевые дрожжи (US-05), а спирты/сложные эфиры во всех образцах были ниже порогового вкусового восприятия (хотя комбинации различных спиртов/сложных эфиров ниже порогового значения может все же иметь синергетическое влияние на вкус), это подтверждает отчеты пивоваров, которые сообщали, что добавление молочной кислоты в пиво и закисление пива с помощью Lactobacillus делает пиво разным, а также утверждения пивоваров о том, что предварительное закисление сусла с помощью Lactobacillus снижает дрожжевой характер итогового пива. Интересно отметить, что как пиво подкисленное L. buchneri, так и пиво с добавлением только молочной кислоты имели одинаково значительно более низкий уровень пировиноградной кислоты по сравнению с пивом, сброженным только на дрожжах, а также меньшую мутность, что указывает на то, что молочная кислота сама по себе ингибирует количество пировиноградной кислоты, продуцируемой дрожжами, а также помутнение (возможно, потому, что более низкий pH снижает образование белкового и полифенольного помутнения, или, возможно, более низкий pH увеличивает флокуляцию дрожжей).

В этом исследовании также сравнивались два предварительно закисленных сорта пива с L. buchneri, где одно было прокипячено и охмелено после закисления, а другое не кипятилось, а вместо этого смешано с охмеленным суслом перед ферментацией (жизнеспособность L. buchneri была значительно снижена, но не полностью убита в пиве, в которое добавлено охмеленное сусло, в отличии от прокипяченного сусла). Пиво, которое было смешано с охмеленным суслом, в конечном итоге имело больше всего уксусной кислоты (все еще ниже порогового значения) и самый высокий уровень сложных эфиров с фруктовым вкусом: этилгептаноата и этилоктаноата, что указывает на то, что если Lactobacillus дать возможность жить, то пиво со временем будет усложняться. Ни в одном из сортов пива не было существенных различий в отношении производства этанола или CO2, также не произошло терминального кислотного шока (вероятно, потому что крепость пива была только 4% и 3,6 pH, в отличие от 8,4% и 3,17 pH у пива, испытанного в этом исследовании terminal acid shock study by Rogers et al.). Важно отметить, что общие сенсорные различия, о которых сообщалось в этом исследовании, между пивом, закисленным с использованием L. buchneri, и пивом, закисленным с использованием молочной кислоты, были незначительными с точки зрения статистического анализа.

Закисление сусла с Lactobacillus может остановить или замедлить последовательное брожение дрожжей. Вероятно, это связано с низким уровнем pH. Присутствие молочной кислоты может изменить способ ферментации дрожжей, позволяя им потреблять разные типы сахаров независимо от того, присутствует ли в сусле глюкоза или нет, хотя было продемонстрировано, что само по себе это не является причиной остановки брожения (подробнее см. Lactic Acid ). Peyer et al. (2017) наблюдали, что рост US-05 составлял 82% при pH 3,51 и 53% при pH 3,17. Начало брожения задерживалось на 2-4 дня (чем ниже pH, тем дольше откладывалось начало ферментации). При совместной ферментации Lactobacillus amylovorus и US-05 первоначальный рост L. amylovorus продолжался в течение 3 дней, в то время как рост US-05 задерживался. На 7-й день US-05 восстановился и продолжил рост, а рост Lactobacillus замедлился, начиная с 5-го дня. Это произошло из-за увеличения содержания этанола в результате ферментации, более низкого pH и истощения питательных веществ для Lactobacillus. Также возможно, что дрожжи выиграли от автолиза Lactobacillus, который, как предполагается, высвобождают питательные вещества, доступные дрожжам. С этим согласилась и магистерская диссертация Сантери Тенховирта. Он засеял несколько видов Lactobacillus и оставил их на 48 часов, а затем засеял Fermentis US-05. Контрольная ферментация US-05 без каких-либо Lactobacillus началась, как и ожидалось, через 20 часов, в то время как образцам, которые были предварительно подкислены Lactobacillus, потребовалось около 2 дней для начала брожения.

Ciosek et al. (2019) наблюдали противоположный эффект. Более быстрая ферментация была достигнута при внесении Lactobacillus brevis WLP672 (White Labs Inc, США) в течение 1, 2 или 3 дней перед внесением Fermentis Safale US-05. Однако через 7 дней дрожжи достигли несколько более высокой конечной плотности, и рост дрожжей был ниже, чем при внесении дрожжей до или одновременно с WLP672 L. brevis. Интересно, что наименьшая конечная плотность была достигнута, когда дрожжи и L. brevis были внесены одновременно. Это указывает на то, что некоторые виды Lactobacillus могут оказывать синергетическое действие на дрожжи, в то время как другие виды могут быть более антагонистичными по отношению к дрожжам, и что множественные стрессовые факторы, такие как сочетание низкого pH и присутствие этанола, могут препятствовать нормальной аттенюации, в отличии от ситуации с нормальным уровнем pH, который не был понижен из-за присутствия молочной кислоты. Еще одно неожиданное наблюдение было сделано Ciosek et al. (2019) для образцов, которые сначала ферментировались US-05, а затем через 1, 2 или 3 дня засеивались WLP672 L. brevis и позволяли ферментироваться в течение 7 дней: в этих образцах не было значительного падения pH из-за работы L. brevis и pH оставался равным 4,0 или выше. Этот результат указывает на то, что конкретно этот штамм не вырабатывает много молочной кислоты в присутствии этанола или после дрожжевой ферментации не остается достаточно простых сахаров (по крайней мере, за тот короткий промежуток времени, в течение которого проводились тесты). Когда L. brevis был засеян первым, потребовалось 72 часа для того, чтобы pH опустился ниже 4, но в этом случае получился самый низкий уровень pH после завершения дрожжевого брожения (~ 3,4 pH), а совместное внесение культур привело к ~ 3,7 pH. Исследователи заявили, что только когда L. brevis позволили бродить самостоятельно в течение 2-3 дней до внесения дрожжей, готовое пиво имело достаточно содержания молочной кислоты, чтобы считаться «кислым пивом» (~ 6 г / л молочной кислоты для образцов, сначала ферментированных L. brevis, по сравнению с 1,8-2,8 г / л для всех других образцов), что основано на определении Майкла Тонсмайра из книги "American Sour Beers", в котором говорится, что кислое пиво должно иметь 3 -6 г / л молочной кислоты. Однако, в этом исследовании не было представлено никаких сенсорных данных, и не проводились измерения титруемой кислотности, а в тезисе Метнера 1987 года о Berliner Weisse сообщалось о 1-3 г/л молочной кислоты при исследовании этого немецкого кислого пива, поэтому вполне возможно, что все образцы пива в этом исследовании имели адекватный кислый вкус.

В исследовании Пейера также было обнаружено увеличение содержания диацетила и ацетоина в пиве, которое было одновременно засеяно L. amylovorus и US-05, по сравнению с пивом, закисленным в котле или закисленным при затирании. Оба эти соединения придают пиву маслянистый вкус. Обычно после первичной ферментации дрожжи восстанавливают диацетил до ацетоина, который затем превращается в бутандиол, однако в этом исследовании во время совместного брожения с Lactobacillus эти преобразования было проигнорированы. С сенсорной точки зрения, пиво, закисленное в котле в исследовании Пейера было «чище» с меньшим количеством посторонних привкусов и сливовым ароматом. Кислое затирание и пиво, закисленное в котле, имели длительное кислое послевкусие, тогда как пиво, сброженное одновременно L. amylovorus и US-05, было описано как имеющее терпкое послевкусие. Авторы предположили, что такое вяжущее послевкусие вызвано автолизом LAB-клеток, который также мог способствовать более сложному вкусовому профилю совместно сброженного пива. Исследования, посвященные тому, как Lactobacillus могут влиять на более характерные штаммы S. cerevisiae, такие как бельгийские штаммы, еще не проводились.

Смотрите также:

Poster for the referenced Peyer study.

Mixed Fermentation Staggered vs Co-pitching (перевод на сайте беер.рф ищите здесь).

Mixed Fermentation without Brettanomyces (перевод на сайте беер.рф ищите здесь).

 

Читать продолжение в третьей части.

Опубликовал(а): Artem1991
Источник: Материалы сайта milkthefunk
Читайте также: Поделиться/оценить Метки/теги:

Будьте вторым кто оценит статью

К сожалению, пока комментариев нет. Но вы можете стать первым!
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи:
Регистрация Вход